Российские ученые впервые показали эффективность модуляторов аденозиновых А1 рецепторов клеток мозга для подавления эпилептиформной активности. Показано, что использование модуляторов может помочь обойти побочные эффекты, связанные с воздействием прямых синтетических активаторов рецепторов за счет уменьшения концентрации этих активаторов. Именно побочные эффекты прямых активаторов (агонистов), препятствовали рассмотрению А1 рецепторов в качестве мишеней для терапии патологий, связанных с гипервозбуждением нейрональных сетей, в первую очередь эпилепсии.
Коллектив авторов из Института биофизики клетки РАН открыл новый механизм регуляции активности нейронов окружающими их астроцитами путём высвобождения ГАМК в ответ на активацию аденозиновых А1 рецепторов. Работа российских ученых впервые учитывает не только прямое воздействие веществ-активаторов аденозиновых А1 рецепторов на нейроны, но и рассматривает эффекты, возникающие в окружающих нейроны глиальных клетках – астроцитах.
Информация об исследовании опубликована на сайте Минобрнауки России:
https://minobrnauki.gov.ru/press-center/news/nauka/102111/
Также материал о работе пущинских ученых опубликовал «Коммерсантъ Наука»:
https://vk.ru/@-172626558-astrocity-protiv-epilepsii?subtype=primary
https://vk.ru/wall-172626558_8628
Результаты многолетнего исследования, посвящённого изучению молекулярных механизмов антиэпилептического действия активаторов аденозиновых А1 рецепторов, опубликованы в журнале Journal of Neurochemistry (Ryazantseva PE, Gaidin SG, Maiorov SA, Laryushkin DP, Kritskaya KA, Berezhnov AV, Mal'tseva VN, Gorbunova IA, Shipilovskikh DA, Sharavyeva YO, Shipilovskikh SA, Andreev IA, Ratmanova NK, Ivanova OA, Trushkov IV, Apushkin DY, Andreev AI, Ahremenko EA, Maskaeva MA, Batalshchikova SA, Kosenkov AM. Neuroprotective Action of Agonists and Modulators of A1 Adenosine Receptors Upon Hyperexcitation: Mechanism of the Antiepileptic Activity and Role of Neuron-Glial Interaction. J Neurochem. 2026 Sep;170(9):e70556. doi: 10.1111/jnc.70556. PMID: 42770407 ( https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jnc.70556 ).
Авторы исследования работают в лаборатории клеточных механизмов нейропатологий Института биофизики клетки РАН – одной из нескольких лабораторий, организованной в ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН» в 2022 году в рамках программы Минобрнауки России по созданию новых молодёжных лабораторий.
Согласно данным статистики, в России эпилепсией болеют до 1 % населения, тогда как из клинической практики известно, что лишь в 70% случаев заболевание успешно поддаётся медикаментозной терапии. Одобренные антиэпилептические препараты имеют ряд побочных эффектов ввиду обширной экспрессии их мишеней во многих тканях и органах за пределами нервной системы. По этой причине на сегодняшний день продолжается поиск новых антиэпилептических препаратов и разработка альтернативных подходов к терапии с использованием уже применяемых в клинической практике веществ. Сотрудники ИБК РАН при участии коллектива специалистов в области органического синтеза пошли по пути поиска новых соединений. Исходя из ранее полученных данных, коллектив из ИБК выбрал перспективную на их взгляд мишень, а именно аденозиновые А1 рецепторы. Наибольший уровень экспрессии этих рецепторов отмечается в клетках мозга, однако значительное содержание было продемонстрировано в сердечно-сосудистой, дыхательной и выделительной системах. Использование в клинической практике прямых активаторов А1 рецепторов (ортостерических агонистов) ограничено побочными эффектами как раз в первую очередь со стороны сердечно-сосудистой системы. Для обхода этого ограничения коллектив авторов решил использовать не ортостерические агонисты, а позитивные аллостерические модуляторы. В отличие от ортостерических агонистов, модуляторы не активируют рецептор напрямую, а изменяют его сродство к эндогенным или экзогенным синтетическим лигандам. В контексте терапии это означает, что для достижения эффекта требуется намного меньше агониста, а так как концентрация естественного активатора рецепторов, аденозина, больше именно в мозге (в период бодрствования), это минимизирует риск развития побочных эффектов со стороны других органов. Кроме того, повышение концентрации аденозина в тканях отмечается при патологиях и повреждениях, следовательно, позитивные аллостерические модуляторы действуют преимущественно в очаге поражения, что может иметь немаловажное значение при травматических повреждениях или инсультах, одним из отложенных последствий которых в том числе может быть эпилепсия.
Несмотря на то, что антиэпилептический потенциал агонистов А1 аденозиновых рецепторов известен и описан в научной литературе, в том числе группой исследователей из ИБК РАН, точный молекулярный механизм на клеточном уровне ранее не был продемонстрирован. Именно это и стало отправной точкой для данного исследования. На клеточных нейрон-глиальных культурах гиппокампа крысы авторы смоделировали эпилептиформную активность, приближенную к той, которая наблюдается в мозге пациентов с эпилепсией, и при помощи фармакологического ингибиторного анализа выявили внутриклеточные сигнальные белки, ответственные за реализацию противоэпилептического действия, среди которых Gβγ-субъединица А1 рецепторов, фосфолипаза С и кальций-зависимая протеинкиназа С.
Хотя антиэпилептическое действие активаторов А1 аденозиновых рецепторов в научной литературе связывали с их влиянием на активность нейронов, а именно на подавление секреции нейротрансмиттеров в пресинаптических терминалях и снижение возбудимости в постсинаптических терминалях за счёт модуляции активности ионных каналов, подобное одностороннее рассмотрение вопроса не соответствует сложной архитектуре нейрон-глиальных сетей мозга, где нейроны образуют тесные контакты с глиальными клетками, в первую очередь астроцитами. Подобного рода взаимодействия, как было показано коллективом из ИБК РАН, реализуются и в используемом ими объекте исследования – нейрон-глиальной культуре. В этой связи авторы решили оценить вклад астроцитов, а точнее активации их аденозиновых А1 рецепторов, в подавление эпилептиформной активности в нейронах. Для этой задачи авторы использовали метод локальной фиксации потенциала (пэтч-кламп/patch-clamp) – электрофизиологическая методика, заключающаяся в измерении токов и потенциалов мембраны отдельных клеток. В данном случае нейрон, находящийся в контакте с измерительным микроэлектродом, выступал в роли сенсора, воспринимающего активность близлежащих глиальных клеток, в первую очередь астроцитов. Активность нейрональной сети в этом случае была полностью подавлена при помощи "коктейля" фармакологических соединений с целью вычленения активности астроцитов, а именно секреции ими глиотрансмиттеров – веществ, влияющих на активность нейронов. Глиотрансмиттерами могут выступать такие молекулы как аденозин-3-фосфорная кислота (АТФ), глутаминовая кислота (глутамат) и гамма-аминомасляная кислота (ГАМК), которые всегда считались классическими нейротрансмиттерами, то есть веществами, выбрасываемыми одними нейронами с целью регуляции активности других иннервируемых ими нейронов. Однако переворот в понимании роли астроцитов произошёл около 30 лет назад, когда открыли возможность выброса астроцитами классических нейротрансмиттеров, которые для обозначения их глиального происхождения стали называть "глиотрансмиттерами". В ходе экспериментов группа исследователей из ИБК выявила новый, ранее не описанный эффект активации А1 рецепторов – а именно, высвобождение астроцитами ГАМК – тормозного нейромедиатора, который может быть в том числе ответственен за подавление гипервозбуждения при эпилептиформной активности.
Следующим шагом исследования стала проверка эффективности позитивных аллостерических модуляторов аденозиновых А1 рецепторов. В первую очередь в исследовании использовали коммерчески доступные соединения. Использование модулятора совместно с агонистами приводило к снижению эффективной концентрации агониста, необходимой для подавления эпилептиформной активности, более чем в 50 раз. При этом авторы обнаружили, что и сами позитивные аллостерические модуляторы в отсутствие агонистов были способны частично подавлять эпилептиформную активность в нейронах, что объяснялось, по всей видимости, присутствием эндогенного аденозина во внеклеточном пространстве. Эти результаты стали научным обоснованием концепции авторов о том, что с целью минимизации побочных эффектов в качестве антиэпилептических препаратов могут использоваться позитивные аллостерические модуляторы аденозиновых А1 рецепторов даже без введения экзогенных агонистов. Также в ходе исследования авторы выявили ещё один интересный факт, свидетельствующий в пользу оправданности выбора мишени для терапии: активация А1 аденозиновых рецепторов, в отличие от других G-белок-сопряжённых рецепторов, рассматривавшихся в качестве перспективных мишеней (например каннабиноидных рецепторов, активно исследуемых на Западе), приводит не только к подавлению уже индуцированной эпилептиформной активности, но и может предотвращать генерацию такой активности при добавлении агонистов А1 рецепторов до проконвульсанта. Так как антиэпилептические препараты требуется принимать регулярно как раз с целью предотвращения приступов, описанный факт повышает фармакологический потенциал А1 рецепторов.
После апробации коммерчески-доступных позитивных аллостерических модуляторов, коллективом из ИБК РАН был протестирован целый ряд оригинальных синтетических веществ с предположительной аллостерической активностью по отношению к А1 аденозиновым рецепторам. Указанные соединения были получены в рамках ранее опубликованных исследований и охарактеризованы с точки зрения структуры и физико-химических свойств ранее коллегами химиками из Москвы (МГУ им. Ломоносова, Институт органической химии РАН им. Н.Д. Зелинского), Санкт-Петербурга (ИТМО), Перми (ПГНИУ). Из более чем 100 соединений были отобраны лишь несколько веществ, часть из которых представлена в опубликованном исследовании, тогда как другая часть продолжает изучаться в контексте биологического действия и способов применения.
Хотя in vitro эксперименты с использованием нейрон-глиальных культур подтвердили концепцию авторов о противоэпилептическом действии аллостерических модуляторов аденозиновых А1 рецепторов, дополнительную валидацию подхода необходимо было провести в in vivo исследованиях на животных. Для этих задач были использованы лабораторные мыши CD-1. Для проверки антиэпилептического действия и возможных побочных эффектов был использован программно-аппаратный комплекс Мульти-Нейро-СДА, разработанный инженерами из Пермского государственного научно-исследовательского университета и производимый компанией ООО "НПК Открытая Наука". Указанный уникальный исследовательский комплекс был закуплен за счёт финансирования в рамках программы открытия молодёжных лабораторий и в настоящий момент активно используется различными группами исследователей из ИБК РАН для проверки фармакологических эффектов соединений. В состав комплекса входят 16 клеток, оборудованных сейсмоаккустическими датчиками и каналами видеорегистрации, что позволяет в течение нескольких недель изучать и анализировать активность животных. В тесном сотрудничестве с разработчиками (Данила Апушкин, Александр Андреев), являющихся соавторами в публикации, коллектив исследователей из ИБК РАН написал программное обеспечение (Сергей Майоров) для сбора и обработки получаемых данных, а также разработал методику их анализа под специфику проводимого исследования (Денис Ларюшкин, Артём Косенков). Авторы показали, что введение ортостерического агониста до введения проконвульсанта приводило к задержке в генерации судорог по сравнению с контролем, однако, как и ожидалось, у мышей развивались значительные побочные эффекты, проявляющиеся в угнетении двигательной активности. При этом в случае коммерчески-доступных аллостерических модуляторов (были выбраны коммерческие соединения по причине того, что необходимые для in vivo исследований количества оригинальных веществ требовали значительного масштабирования методик синтеза) при однократной инъекции не наблюдалось значимых изменений двигательной активности животных. Тем не менее, как было установлено из экспериментов, однократной инъекции было недостаточно для подавления действия конвульсантов и для достижения эффекта, сопоставимого с действием агонистов, требовалось хроническое введение в течение нескольких дней.
Таким образом, выполненное комплексное исследование подтвердило концепцию авторов об эффективности использования аллостерических модуляторов аденозиновых А1 рецепторов для подавления эпилептиформной активности и стало значительной фундаментальной вехой для дальнейших прикладных исследований. Весь процесс, от проработки концепции и пилотных экспериментов до публикации результатов с учётом всех необходимых доработок и подготовительных работ занял чуть более чем три года. Авторы связывают это с комплексностью всего подхода: по сути в работе изложены данные от молекулярного механизма до первичных лабораторных исследований на животных, вовлечены коллективы не только биологов, но и химиков, и инженеров, задействована материально-техническая база не только лаборатории клеточных механизмов нейропатологий и лаборатории внутриклеточной сигнализации ИБК РАН, но ресурсы лаборатории оптико-спектральных методов анализа, оборудование которой входит в Центр коллективного пользования ФИЦ ПНЦБИ РАН. Не очевидным, но весомым результатом вдобавок к научным данным является апробация программно-аппаратного комплекса Мульти-Нейро СДА в фундаментальных исследованиях, создание уникального, "заточенного" под нужды исследователей программного обеспечения, характеристика в биологических моделях десятков оригинальных соединений и главное - опыт междисциплинарной коллаборации исследователей из разных городов России и привлечение новых кадров в науку. Например, первый автор публикации, Полина Рязанцева, на плечи которой легло подавляющее большинство экспериментов in vitro, начинала эту работу ещё студентом-практикантом из СибГМУ, а втянувшись в неё, довела до финала уже в роли аспиранта Научно-образовательного центра ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН».
На сегодняшний день коллектив из ИБК РАН модифицирует пути введения позитивных аллостерических модуляторов А1 аденозиновых рецепторов, так как коммерческие и оригинальные синтезированные соединения довольно гидрофобны, и расширяет "географию" их применения в нейропатологиях, перейдя от эпилепсии к черепно-мозговой травме с целью создания препарата экстренного применения, купирующего острые негативные эффекты и минимизирующего риск развития посттравматической эпилепсии.
